аханов тема3(1-6) тема 4 (123)

Тема 3. Инсулин

Два способа получения инсулина для практики здравоохранения

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического.

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида — дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами [2]: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом [1] и генно-инженерным способом [3]. В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека [1].

Как уже упоминалось выше (см. статью «Инсулин», Часть I.), инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором — получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В [4, 5] до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

 белок носитель — обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

 аффинный компонент — существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

Превращение инсулина свиньи в инсулин человека

В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического.

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида — дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами [2]: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом [1] и генно-инженерным способом [3]. В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека [1].

Получение генно-инженерного инсулина человека.

включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.

Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Природа гормонального вещества, продуцируемого E.coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.

Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).

В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitroосуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.

Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.

Концептуальные подходы к масштабированию производства генноинженерного инсулина человека

Наиболее прогрессивным методом является биотехнологический, при котором потребляются только энергоресурсы и используются высокопродуктивные генетически измененные микроорганизмы, вырабатывающие инсулин в виде неактивного предшественника (Коледопа*! А 2001) Получение генно-инженерного инсулина является сложным многостадийным процессом, основанным на нескольких этапах трансформации и препаративной очистке промежуточных продуктов и инсулина (Баирамашвили Д И, 2005) Поэтому основными направлениями по оптимизации технологии производства являются поиск легко вписываемых в существующую технологию, дающих заметный выигрыш по времени, уменьшающих себестоимость и легко масштабируемых решений на основе существующего оборудования Цель исследованияПроцесс был основан на продуци-ровании генноинженерным штаммом Е. coli рекомби-нантного белка (молекулярная масса около 17000 Да), содержащего лидерную аминокислотную последова¬тельность, соединенную через аминокислотный оста¬ток метионина с проинсулином человека. Исходная технологическая схема включала в себя следующие стадии:

1.Ферментация (выращивание штамма-продуцентав ферментере).

2.Отделение биомассы.

3.Разрушение клеток с выделением телец включения.

4.Очистка рекомбинантного белка последовательно ионообменной хроматографией н5.Расщепление рекомбинантного белка бромцианом.

6.Окислительный сульфитолиз проинсулина.

7.Хроматографическая очистка гексасульфонатапроинсулина последовательной гель-фильтрацией наСефадексе G-50 F, ионообменной хроматографией наDEAE-сефарозе FF и гель-фильтрацией на сефадексеG-25M.

8.Ренатурация проинсулина.

9.Хроматографическая очистка нативного проинсулина ионообменной хроматографией на DEAEсефарозе FF.

10.Ферментативное расщепление проинсулина.

11.Хроматографическая очистка инсулина ионообменной хроматографией на S-сефарозе FF, ультрафильт¬рацией и гель-фильтрацией на сефадексе G-50 SG.

12.Лиофильная сушка Na-соли инсулина человека.

Очистка инсулина

Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [13]. Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина [14]. В работе [6] авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы [15] разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина. В работе [16] сообщается об исследованиях возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием для определения инсулина и разработана методика [17] определения инсулина, выделенного из островка Лангерганса методом иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием. В работе [18] исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд.

В последнее время большое количество работ посвящено усовершенствованию способов получения инсулина, а также созданию лекарственных форм на его основе. Например, в США запатентованы гепатоспецифические аналоги инсулина [19], структурно отличающиеся от природного гормона за счет введения в положения 13 — 15 и 19 А-цепи и в положение 16 В-цепи иных аминокислотных остатков. Полученные аналоги используются в составе различных парентеральных (внутривенных, внутримышечных, подкожных), интраназальных лекарственных форм или имплантации в виде специальных капсул при лечении сахарного диабета. Особо актуальным является создание лекарственных форм вводящихся без инъекций. В работе [20] сообщается о создании макромолекулярной системы перорального применения , представляющей собой инсулин иммобилизованный в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибиторами протеолитических ферментов. Эффективность такого препарата составляет 70-80 % от эффективности подкожно введенного нативного инсулина. В другой работе [21] лекарственный препарат получают одноэтапной инкубацией инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1-4:100, в присутствии связывающего агента. Авторы сообщают о получении лекарственного препарата с активностью 1000 ед./г., полном сохранении активности при пероральном введении и хранении в течение нескольких лет в лиофилизированном виде.

Кроме создания новых лекарственных препаратов и лекарственных форм на основе инсулина, разрабатываются новые подходы к решению проблемы сахарного диабета. Так, авторы работы [22] трансфицировали кДНК белка-переносчика глюкозы GLUT2 предварительно стабильно трансфицированные полноразмерной кДНК инсулина клетки НЕР G2 ins. В полученных клонах НЕР G2 Insgl глюкоза стимулирует близкую к нормальной секрецию инсулина и потенцирует секреторный ответ на другие стимуляторы секреции. При иммуноэлектронной микроскопии в клетках обнаружены содержащие инсулин гранулы, морфологически сходные с гранулами в b-клетках островков Лангерганса. В настоящий момент серьезно обсуждается возможность применения для лечения сахарного диабета 1 типа «искусственной b-клетки», полученной методами генной инженерии.

Наряду с решением практических проблем изучаются и механизмы действия инсулина, а также структурно-функциональные отношения в молекуле. Одним из способов исследования является создание различных производных инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств [23, 24]. Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. В настоящее время для С-пептида показано наличие биологической активности, что позволяет использовать его в терапевтических целях наряду с инсулином.

Тема 4. Антибиотики

Идентификация инсулина

В основе этой методики – искусственные антитела, нанесённые на поверхность полимерных крупинок. Они целенаправленно связывают инсулин, и только инсулин, – точно так же, как их природные аналоги – клетки иммунной системы – находят и захватывают вполне определённых возбудителей болезни. Затем «улов» с крупинок смывается и анализируется с помощью обычного масс-спектрометра – прибора, входящего сегодня в комплект стандартного оборудования любой лаборатории аналитической химии. Эти своего рода молекулярные весы до недавнего времени были недостаточно чувствительны, чтобы с их помощью можно было выявлять в моче такие относительно тяжёлые белковые соединения как инсулин. В отличие от биосинтетических инсулинов животного происхождения, получаемых из поджелудочных желёз свиней или крупного рогатого скота, человеческий инсулин, производимый в биореакторах с помощью генетически модифицированных бактерий, в химическом отношении ничем не отличается от природного. 

1 Пробоподготовки, включающей оптимизацию хроматографических условий разделения методом ОФ ВЭЖХ реакционной массы, полученной при синтезе гликозилированного производного инсулина, на фракции с целью последующего их анализа;

2. Выделение и наработку фракции, содержащей модифицированный инсулин;

3. Установление факта образования (наличия) гликозилированного производного

инсулина путем МС-анализа выделенных фракций;

4. Определение в молекуле инсулина сайта присоединения гликозилирующего

агента, предусматривающее фрагментацию гликозилированного производного путем

специфического ферментативного гидролиза, разделение фрагментов гидролизата

методом ВЭЖХ, МС-идентификацию выделенных фрагментов с целью определения

того, который содержит гликозидный остаток.

Первые две стадии позволяют подтвердить образование искомого конъюгата, а последующие — установить его строение.

Производство готовых лекарственных форм инсулина

3,571 г субстанции инсулина человека суспендировали в 150 мл воды, затем с помощью 1 М НСl рН суспензии довели до 3,1 для растворения кристаллов субстанции. 0,318 г протаминсульфата растворили в 25 мл воды и довели рН раствора до 3,1, добавляя 1 М НСl. 0,0225 г цинка хлорида добавили к раствору протаминсульфата. Потом смешали раствор субстанции инсулина человека и раствор, который содержал протаминсульфат и цинка хлорид.

После этого приготовили буферный раствор, который содержал 2,5 г натрийдигидрогенфосфата дигидрата, 1,5 г м-крезола, 0,6 г фенола, 16 г глицерина и 0,2 г натрия хлорида в объеме 800 мл и довели рН буферного раствора до 7,8, провели стерилизующую фильтрацию и профильтровали туда смесь кислых растворов субстанции инсулина человека, протаминсульфата и цинка хлорида. Полученную смесь выдерживали при перемешивании 18 часов при температуре 18°С для получения кристаллической суспензии готового лекарственного препарата. Готовый препарат разлили в асептических условиях в картриджи емкостью 1,5 и 3,0 мл. Готовый препарат проанализировали методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Анализ показал практическое отсутствие инсулина в супернатанте при общем содержании инсулина 98 МЕ/мл. Содержание высокомолекулярных белков составило 0,2%. Форму и размер кристаллов определяли с помощью микроскопа при 400-кратном увеличении. Кристаллы имели тетрагональную форму и длину от 1 до 25 мкм.

Готовая лекарственная форма инсулина человека пролонгированного действия, содержащая высокоочищенную субстанцию инсулина человека, протаминсульфат, цинка хлорид, глицерин, м-крезол, фенол и воду, отличающаяся тем, что высокоочищенная субстанция инсулина человека имеет остаточную протеолитическую активность не более 0,005 адсорбционных единиц, а композиция содержит натрийдигидрогенфосфат дигидрат или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат и дополнительно натрий хлорид и имеет рН 6,9-7,8 при следующем соотношении компонентов, г/л:

высокоочищенная субстанция инсулина человека 3,214-3,928

протаминсульфат 0,238-0,318

цинка хлорид 0,014-0,0225

глицерин 14-18

м-крезол 1,4-1,6

фенол 0,5-0,7

натрийдигидрогенфосфат дигидрат 2,4-2,8

или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат 2,0-2,3

натрия хлорид 0,15-0,3

вода остальное

Изучение фармакологических и токсикологических свойств инсулина

По скорости наступления эффектов и их продолжительности различают : а) препараты быстрого короткого действия (актрапид, актрапид МС, актрапид НМ, инсулрап, хоморап 40, инсуман рапид). Начало действия — через 15-30 минут, длительность 6-8 часов; б) средней продолжительности действия (начало действия через 1-2 часа, общая продолжительность эффекта — 12-16 часов); — семиленте МС; — хумулин Н, хумулин ленте, хомофан; ленте МС, монотард МС (2-4 часа и 20-24 часов соответственно); — илетин I НПХ, илетин II НПХ; — инсулонг СПП, инсулин ленте GPP, в) средней продолжительности в смеси с инсулином короткого действия: (начало действия 30 минут; длительность — от 10 до 24 часов); актрафан НМ; хумулин М-1; М-2; М-3; М-4 (продолжительность действия до 12-16 часов); инсуман комб. 15/85; 25/75; 50/50 (действует в течение 10-16 часов). г) препараты длительного действия : ультраленте, ультраленте МС, ультраленте НМ (до 28 часов); инсулин суперленте СПП (до 28 часов); хумулин ультраленте, ультратард НМ (до 24-28 часов).

АКТРАПИД, из бета-клеток островков поджелудочной железы свиньи, выпускается как официнальный препарат во флаконах по 10 мл, с активностью по 40 ЕД в 1 мл. Вводят парентерально, под кожу. Быстрое сахаропонижающее действие. Эффект развивается через 15-20 минут, а пик действия отмечается через 2-4 часа. Продолжительность сахароснижающего влияния — 6-8 часов у взрослых, у детей до 8-10 часов.

Достоинства препаратов инсулина быстрого короткого действия (актрапида) : 1) действуют быстро; 2) дают физиологический пик концентрации в крови; 3) действуют кратковременно.Основной недостаток — кратковременность действия, что требует повторных инъекций . Показания для использования препаратов инсулина быстрого короткого действия : 1. Лечение больных инсулинзависимым сахарным диабетом. Препарат вводят под кожу. 2. При самых тяжелых формах инсулиннезависимого сахарного диабета у взрослых. 3. При диабетической (гипергликемической) коме. В этом случае препараты вводят как под кожу, так и в вену. 5. Препараты могут входить в состав поляризующей смеси (калий, глюкоза и инсулин) для поддержания работы миокарда при сердечных аритмиях 6. Лицам с инсулиннезависимым сахарным диабетом при проведении полостных и других больших оперативных вмешательств, при инфекционных заболеваниях.

Инсулины пролонгированного действия. Наличие основных белков — протамина и глобина, цинка, а также солевого буфера изменяет скорость наступления сахароснижающего эффекта, время максимального действия, пик действия и общую продолжительность действия. В результате получается суспензия, которая медленно всасывается, поддерживая невысокую дозу препарата в крови в течение длительного времени. Вводятся все только подкожно. Достоинства пролонгированных препаратов инсулина : 1) препараты вводятся всего два или один раз в сутки; 2) препараты имеют высокий рН, что делает их инъекции менее болезненными и инсулин действует быстрее. Недостатки : 1) отсутствие физиологического пика, из чего следует, что эти препараты нельзя вводить больным с тяжелой формой сахарного диабета и их следует использовать при относительно легких и среднетяжелых формах; 2) препараты категорически нельзя вводить в вену (во избежание эмболии); Осложнения

1. развитие ГИПОГЛИКЕМИИ. Этому способствуют : передозировка; несоответствие введенной дозы и принятой пищи; большая физическая нагрузка; заболевания печени и почек; Первые клинические симптомы гипогликемии (вегетотропные эффекты «быстрых» инсулинов): раздражительность, беспокойство, мышечная слабость, депрессия, изменение остроты зрения, тахикардия, потливость, тремор, бледность кожных покровов, «гусиная кожа», чувство 2. Аллергические реакции в виде зуда, гиперемии, болевых ощущений в месте введения; крапивница, лимфоаденопатия.

3. Развитие резистентности к инсулину. Данный факт связывают с выработкой антител к инсулину. 4. Липодистрофия в месте инъекций. В этом случае следует изменить место введения препарата. 5. Снижение концентрации калия в крови, что необходимо регулировать при помощи диеты.




Предыдущий:

Следующий: